Tahan alustada meeldetuletusega, mis avalikes aruteludes tihtipeale ununema hakkab: Covid mRNA vaktsiinid on tõeliselt uudsed meditsiinitooted.
Enne 2020. aasta erakorralisi lube polnud mRNA-vaktsiinitehnoloogiat kunagi inimestel ulatuslikult kasutusele võetud. Ainult kaks kliinilist uuringut, üks Pfizer-BioNTechi ja teine Moderna poolt, olid seda platvormi inimestel testinud. Kokku oli meditsiini ajaloos mRNA-vaktsiini saanud umbes 37 000 inimest (välja arvatud varasemad kogemused marutaudi, CMV ja vähivaktsiinidega, mis piirdusid palju väiksemate varajase faasi uuringutega). See ei ole kriitika; see on lihtsalt faktiväide. Kuid see tähendab, et nende toodete pikaajaline ohutusprofiil oli ja on endiselt puudulikult mõistetav.
Järgnev on tuttav peaaegu kõigile molekulaarbioloogidele. See on keeruline, aga arvestades kaalulolevaid asjaolusid, püüan seda lihtsustada. Oluline on molekulaarne raamistik kõigile selgelt välja tuua, sest see, kuidas neid vaktsiine valmistatakse, määrab otseselt, mis on viaali sisus.. Ja pärast süstimist viaali sisu liigub see kogu kehas laiali ja käivitab sündmuste kaskaadi, millel võivad olla pikaajalised tervisemõjud.
In vitro transkriptsioon ei ole ainult tootmise detail
Modifitseeritud mRNA-vaktsiinid toodetakse protsessi abil, mida nimetatakse in vitro transkriptsiooniks (IVT)IVT on meetod, mida kasutatakse modifitseeritud mRNA sünteesimiseks, millest saab lõpuks vaktsiini toimeaine.
See ei ole tühine tehniline nüanss. IVT kujundab põhimõtteliselt lõpptoote molekulaarset koostist.
BioNTechi teadlased, sealhulgas need, kes olid otseselt seotud Pfizeri vaktsiini väljatöötamisega, on avaldanud üksikasjaliku ülevaate.1 kirjeldades, kuidas IVT reaktsioonid genereerivad mitte ainult kavandatud täispikka mRNA-d, vaid ka mitmesuguseid kõrvalsaadusi ja lisandeid, kuidas neid tavaliselt eemaldatakse ja millised võivad olla nende bioloogilised tagajärjed, kui need püsivad. Neid tootmisjuhiseid koos nende tekitatud kõrvalsaadustega kirjeldas Moderna oma patentides (US10 653 712 B2 ja US10 077 439 B2) üksikasjalikult. Kuid mis veelgi olulisem, see molekulaarbioloogia oli juba ammu enne koroonat hästi välja kujunenud. Miski selles pole spekulatiivne.
Lähtematerjal: DNA mallid
Sisuliselt algab IVT-reaktsioon kaheahelalise DNA-ga, mis kodeerib soovitud valku. Antud juhul SARS-CoV-2 ogavalku.
mRNA-vaktsiinides kasutatav oga kodeeriv järjestus on geneetiliselt muundatud stabiilsuse ja rakulise tolerantsuse parandamiseks, sealhulgas kaks aminohappeasendust, mis eristavad seda viiruslikust ogast. See modifikatsioon on tahtlik.
DNA mall ise võib esineda erinevates vormides. Pfizeri varajastes kliinilistes uuringutes kasutati PCR-i abil genereeritud DNA fragmente. Kaubanduslik tootmisprotsess tugines aga plasmiididest saadud DNA-le. See on oluline, sest plasmiidid sisaldavad täiendavaid regulatiivseid järjestusi. Pfizeri puhul hõlmavad need selliseid elemente nagu SV40 promootor ja ori-järjestused, mis tekitavad muret, kui need peaksid inimese rakkudesse sisenema.
Kui see DNA matriits on koos RNA polümeraasi ja teiste komponentidega IVT reaktsioonisegusse lisatud, transkribeeritakse see mRNA-ks (joonis 1).
IVT toodab disaini abil kõrvalsaadusi
Kuigi IVT soovitud väljundiks on kavandatud täispikk mRNA produkt, on tegelik väljund keerukam. Nende hulka kuuluvad mitmesugused kõrvalproduktid (1) erinevate RNA liikide, sealhulgas kaheahelalise RNA (dsRNA), (2) RNA-ga seotud DNA (RNA-DNA hübriidid) ja (3) algse matriitsi vaba DNA kujul (joonis 2).
Nende kõrvalsaaduste teke on hästi dokumenteeritud ja vältimatu ning seetõttu on allavoolu puhastamine ohutuse tagamiseks hädavajalik.
Joonis 2. IVT tootmise kõrvalsaadused ja saasteained. Pilt on kohandatud allikast. 1.
Puhastamisel on teadaolevad piirangud
Pärast tootmist on vaja kahte puhastamisetappi: esmalt DNA eemaldamine ja seejärel RNA kõrvalsaaduste eemaldamine (joonis 3):
Joonis 3. IVT kõrvalsaaduste eemaldamine. Pilt on kohandatud allikast. 2.
DNA eemaldamiseks lisatakse reaktsioonisegule ensüüm nimega DNaas I, mida tavaliselt kasutatakse saastava DNA lagundamiseks. Kuigi DNaas I on efektiivne vaba matriits-DNA vastu, näitavad mitmed uuringud, sealhulgas BioNTechi teadlaste endi töö, et DNaas I ei ole RNA-le kinnitunud DNA (RNA-DNA hübriidide) eemaldamisel efektiivne.
See piirang ei ole vastuoluline. See on kirjanduses dokumenteeritud.
Mida on näidanud sõltumatud analüüsid
See kontekst on ülioluline valmis vaktsiiniviaalide hiljutiste sõltumatute analüüside tõlgendamisel.
Uurijad 3 ja regulaatorid4 on teatanud DNA saasteainete tuvastamisest praktiliselt igas testitud viaalis. Nende saasteainete hulka kuulusid nii kaheahelaline DNA kui ka RNA-DNA hübriidid, mis tundusid olevat resistentsed DNaas I seedimise suhtes.
Mõnes proovis oli oga kodeerivat DNA-d rohkem kui 100 korda rohkem kui teistes plasmiidjärjestustes5, mis viitab ebaühtlasele või mittetäielikule seedimisele. Sekveneerimise ja kvantitatiivse PCR-analüüsi abil tuvastati täiendavalt DNA fragmente, mille keskmine pikkus oli ~200 aluspaari, mõned neist ületasid 4 kilobaasi. Mitmel juhul täheldati peaaegu kogu plasmiidi hõlmavaid järjestusi.
Kokkuvõttes tekitavad need leiud tõsiseid küsimusi puhastamise järjepidevuse ja täielikkuse kohta suurtootmise ajal ning jääknukleiinhapete võimalike bioloogiliste tagajärgede kohta inimestel.
Miks nukleiinhappe saasteained on bioloogiliselt olulised?
RNA ja DNA on kaasasündinud immuunradade tugevad aktivaatorid. See ei ole spekulatiivne väide. Mustrite äratundmise retseptorid ja cGAS-STING rada reageerivad võõrastele nukleiinhapetele tugevalt, vallandades põletiku, kasvu pärssimise ja isegi rakusurma.
Just need mehhanismid ongi põhjus, miks geeniteraapia tooted on range ohutusjärelevalve all.
Iroonilisel kombel olid Covidi mRNA vaktsiinid spetsiaalselt modifitseeritud just selleks, et seda tugevat kaasasündinud immuunaktivatsiooni vähendada. Kuid RNA-DNA hübriidid ja DNA fragmendid kutsuvad nendest modifikatsioonidest hoolimata esile tugeva immuunvastuse.
Püsivus tekitab uusi küsimusi
Nüüd on olemas olulisi tõendeid selle kohta, et oga-mRNA ja -valk püsivad inimese kudedes nädalaid, kuid ja isegi aastaid pärast vaktsineerimist (tabel 1).
Me ei tea veel, kas see püsivus peegeldab pikaajalist mRNA stabiilsust, jätkuvat translatsiooni või DNA-põhiseid mehhanisme. Kuid arvestades DNA integratsiooni usutavust ja pikaealist mitteintegreerunud plasmiidset DNA-d lihasrakkudes,6 Pole ebamõistlik eeldada, et Spike'i mRNA, valgu ja Spike'i-vastaste antikehade püsivus aastaid pärast vaktsineerimist ei ole seotud IVT-le järgnevate DNA lisandite ja kõrvalsaadustega.
Tabel 1. Vaktsineerimise järgselt inimestel esineva spike mRNA ja valgu püsivus
Lühi- ja pikaajalised ohutusmõjud
Kokkuvõttes tõstatavad need andmed mitmeid olulisi ohutusalaseid kaalutlusi.
Esiteks on vaktsineerimisele järgnenud ägedaid immuunreaktsioone, sh tsütokiinitorme ja anafülaksiat, kirjeldatud kohe. Selliseid tugevaid põletikulisi reaktsioone ei tohiks otseselt lisanditega mitteseotuks pidada, eriti arvestades seda, mida teatakse nukleiinhapete poolt indutseeritud immuunaktivatsiooni kohta.
Teiseks ja veelgi olulisemad on pikaajalised riskid. Püsiv ogaekspressioon võib usutavalt kaasa aidata krooniliste immuunsündroomide tekkele. Veelgi murettekitavam on DNA integratsiooni võimalus, mis kaasneb insertsioonilise mutageneesi või geenihäirete riskiga. See tähendab vähi või arenguhäirete ohtu olenevalt sellest, kuhu ja mis vanuses DNA integreerus.
Tähelepanuväärne on see, et FDA ise väidab oma infolehtedel, et need vaktsiinid ei ole... seda on hinnatud kantserogeensuse (vähi teke) või genotoksilisuse (DNA kahjustus) suhtes, mis oleks rutiinne ja eeldatav punkt geeniteraapia järelevalves, kus pikaajaline jälgimine on standardne.
mRNA-vaktsiinides sisalduva DNA regulatiivne lünk
Kuna mRNA-vaktsiinides sisalduva jääk-DNA osas pole enam mingit vaidlust, on küsimus selles, kas praegused juhised ja ohutuspiirid on mRNA-vaktsiinide jaoks sobivad. Meile on kinnitatud, et DNA kõrvalsaadused jäävad regulatiivsetes juhistes sätestatud piiridesse. Millised on siis FDA juhised DNA kõrvalsaaduste ja saasteainete kohta?
FDA kõige sagedamini tsiteeritud juhised jääk-DNA kohta (≤10 ng annuse kohta) töötati välja viirusvaktsiinide jaoks, mis on toodetud fragmenteeritud ja „paljastes“ elusrakkudes, millel on piiratud võime siseneda inimese rakkudesse. mRNA-vaktsiine aga ei toodeta rakkudes, nende jääk-DNA ei pärine peremeesrakust ja mis kõige tähtsam, mRNA-vaktsiinides olev DNA ei ole paljas. See on seotud LNP-manustamissüsteemidega, mis muudavad DNA-l rakkudesse sisenemise väga lihtsaks. FDA 2010. aasta juhised on selged, et need ei kehtesta LNP-põhiste toodetega seotud DNA-le asjakohast ohutusläve.
Teine sageli tsiteeritud juhis pärineb WHO-lt rekombinantsete valguravimite kohta, mis käsitlevad jääk-DNA-d sellistes toodetes nagu monoklonaalsed antikehad või hormoonid, mis on toodetud konstrueeritud rakkudes. Ka siin pärineb jääk-DNA peremeesrakkudest või ekspressiooniplasmiididest, esineb jälgedena, kapseldamata DNA-na (paljas) ja lõpptoode on puhastatud valk, mitte nukleiinhappepõhine ravi (mRNA-vaktsiin). Seega ei kehti see juhis mRNA-vaktsiinide kohta.
Ei FDA ega WHO regulatiivsed standardid, mida jääk-DNA puhul kõige sagedamini viidatakse, ei olnud mRNA-vaktsiinide jaoks välja töötatud ja ei käsitle seda ohutusprobleemi otseselt.
Mida WHO ütles mRNA-vaktsiinide kohta – pärast kasutuselevõttu
2022. aastal avaldas Maailma Terviseorganisatsioon juhised, mis käsitlesid spetsiaalselt mRNA-vaktsiine.7Tähelepanuväärne on see, et see dokument avaldati pärast nende toodete ülemaailmset turuletoomist. Seal on konkreetselt öeldud, et see juhend oli vastuseks järgmisele: „selle uue tehnoloogiaga seotud ohutus-, tootmis- ja regulatiivsed küsimused.Dokumendis on ka mitu olulist väidet:
"Kuna tootmismeetodite kohta pole veel üksikasjalikku teavet saadaval, ohutute ja tõhusate mRNA-vaktsiinide kontrollimeetmed ei ole veel standardiseeritud ning teatud üksikasjad jäävad konfidentsiaalseks ja seega avalikult kättesaamatuks, ei ole praegu võimalik välja töötada spetsiifilisi rahvusvahelisi suuniseid ega soovitusi."
Lisaks on seal kirjas: „Üksikasjalikud tootmis- ja kontrolliprotseduurid ... tuleks arutada ja heaks kiita NRA [riikliku reguleeriva asutusega].] iga üksikjuhtumi puhul eraldi."
WHO tunnistab, et mRNA-vaktsiinide kontrollimeetmed ei olnud veel standardiseeritud ning et konkreetsete rahvusvaheliste suuniste või soovituste kehtestamine ei olnud teostatav. Lisaks on riiklike ametiasutuste poolt iga juhtumi eraldi hindamiseks vaja regulatiivset järelevalvet.
See öeldi pärast mRNA-vaktsiinide kasutuselevõttu..
Ja selle alamülevaate kirjutamise seisuga ei ole FDA ikka veel kehtestanud mRNA-vaktsiinide standardiseeritud juhiseid ega esitanud mingeid tõendeid ja ohutuspõhiseid andmeid, mis toetaksid DNA piiranguid mRNA-vaktsiinides.
Lõpuks väärib kordamist: kuigi mRNA-tehnoloogia pole uus, reguleeriti seda enne koroonaviirust geeniteraapiana, mitte traditsioonilise vaktsiinina. Koroonaviiruse vaktsiinide DNA kõrvalsaadustega seotud ohutusprobleemid on samad iga mRNA-vaktsiini puhul, sealhulgas gripi-, RSV- või isegi vähivastaste mRNA-vaktsiinide puhul.
Seda seetõttu, et mRNA produktid on põhimõtteliselt erinevad. Nad peavad sisenema rakkudesse ja andma neile juhised võõra valgu tootmiseks. See erineb kõigist teistest tavapärastest vaktsiinidest, mis manustavad valku otse. Sellel platvormil puudub kliiniline pretsedent ja korduval manustamisel puudub kliiniline pretsedent. Ja kindlasti mitte populatsioonimastaabis.
Praeguses etapis, kus pandeemiat pole, kogunevad mehhanistlikud andmed ja kliinilised vaatlused ning turule jõuab üha rohkem mRNA-vaktsiine, vajame läbipaistvust ja otsest seotust regulaatorite tõsiste ohutusuuringutega, eriti FDA-ga, mis kehtestab nende toodete tootmiseks olulised suunised – eriti mis puudutab DNA kõrvalsaadusi.
Uudne tehnoloogia nõuab uudset uurimist – mitte vaikimist, spekulatsioone ega tsensuuri.
Tehtud tööd
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S jt Mol Pharm. 2022 4. aprill;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang jt (2004) – „Plasmiidse DNA integratsiooni tuvastamine peremeesorganismi genoomsesse DNA-sse pärast intramuskulaarset süstimist ja elektroporatsiooni“ (Gene Therapy, 2004). Hiirtele süstiti paljast plasmiidset DNA-d intramuskulaarselt, millele järgnes elektroporatsioon omastamise suurendamiseks. Kasutades puhastatud genoomse DNA ülitundlikku PCR-i (geeli eraldamisega ekstrakromosomaalsete vormide eemaldamiseks), tuvastasid autorid 4 nädalat pärast süstimist neli sõltumatut integratsioonisündmust. Ühenduste järjestamine kinnitas juhuslikke integratsioonisaite (eelistatud levialasid ei olnud), mis on kooskõlas mittehomoloogse otsaühendusega. Integratsiooni sagedus oli madal, kuid mõõdetav. See on üks selgemaid näiteid palja plasmiidse DNA tegelikest spontaansetest integratsioonisündmustest in vivo lihastes. Märkimist väärib see, et selles uuringus kasutati parendatud DNA kohaletoimetamist elektroporatsiooni teel, mida saab võrrelda parendatud kohaletoimetamisega LNP-de kaudu.
Martin jt (1999) – „Plasmiid-DNA malaariavaktsiin: genoomse integratsiooni potentsiaal pärast intramuskulaarset süstimist“ (Human Gene Therapy). See varasem uuring testis plasmiid-DNA IM-i hiirtel ja kasutas integratsiooni uurimiseks Southern blot hübridisatsiooni ja PCR-i suure molekulmassiga genoomsel DNA-l. Kuigi püsivus oli enamasti ekstrakromosomaalne, esitasid nad tõendeid, mis viitasid haruldasele integratsioonile mõnedes proovides (kuigi mitte nii lõplikult sekveneeritud kui hilisemates töödes). See seadis madala riski võrdlusaluse, kuid tunnistas potentsiaali väga madala sagedusega sündmusteks, mis mõjutas FDA hilisemaid suuniseid DNA-vaktsiinide kohta.
Ledwith jt (2000) – „Plasmiid-DNA vaktsiinid: peremeesraku DNA-sse integreerumise uuring pärast intramuskulaarset süstimist hiirtele“ (Intervirology). Paljas plasmiid-DNA intramuskulaarse süstimise järel hiirtele ilmnes, et kuigi tuvastatavat integratsiooni ei täheldatud, oli DNA siiski tuvastatav nelipealihases kuni 26 nädalani. DNA oli ekstrakromosomaalne.
7 WHO bioloogilise standardimise ekspertkomitee 74. aruande lisa 3. Nakkushaiguste ennetamiseks mõeldud messenger-RNA vaktsiinide kvaliteedi, ohutuse ja efektiivsuse hindamine: regulatiivsed kaalutlused https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
-
Dr Charlotte Kuperwasser on silmapaistev professor Tuftsi Ülikooli Meditsiinikooli Arengu-, Molekulaar- ja Keemilise Bioloogia osakonnas ning Tuftsi Ülikooli Konvergentsi Laboratooriumi direktor. Dr Kuperwasser on rahvusvaheliselt tunnustatud oma piimanäärmete bioloogia, rinnavähi ja ennetamise alase asjatundlikkuse poolest. Ta on immuniseerimistavade nõuandekomitee liige.
Vaata kõik postitused
